Les stimuli inflammatoires induisent l'excrétion d'héparane sulfate des cellules endothéliales porcines artérielles mais non veineuses, entraînant des réponses pro-inflammatoires et procoagulantes différentielles

Aug 25, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4483 (2023) Citer cet article

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La dysfonction endothéliale est un événement précoce de lésion vasculaire défini par un phénotype pro-inflammatoire et procoagulant des cellules endothéliales (CE). Bien que la perturbation endothéliale du glycocalyx soit associée à des lésions vasculaires, on ne sait pas comment divers stimuli inflammatoires affectent le glycocalyx et si les cellules artérielles et veineuses réagissent différemment. À l'aide d'un système microfluidique à canaux ronds 3D, nous avons étudié le glycocalyx endothélial, en particulier l'héparane sulfate (HS), sur les CE artérielles et veineuses porcines. L'expression de sulfate d'héparane (HS)/glycocalyx a déjà été observée dans des conditions statiques sur les EC veineux alors qu'elle était dépendante du débit sur les cellules artérielles. De plus, l'analyse de la réponse HS/glycocalyx après stimulation avec des signaux inflammatoires a révélé que les EC veineux, mais pas artériels, sont résistants à l'excrétion de HS. Cette découverte a également été observée sur des vaisseaux porcins isolés. La persistance de HS sur les EC veineux a empêché le dépôt de complément et la formation de caillots après stimulation avec le facteur de nécrose tumorale α ou le lipopolysaccharide, alors qu'après l'activation xénogénique, aucune protection médiée par le glycocalyx n'a été observée. Au contraire, l'excrétion de HS sur les cellules artérielles, même sans agression inflammatoire, était suffisante pour induire un phénotype pro-inflammatoire et procoagulant. Nos données indiquent que la réponse dimorphique des EC artériels et veineux est en partie due à une dynamique HS/glycocalyx distincte suggérant que les troubles thrombo-inflammatoires artériels et veineux nécessitent des thérapies ciblées.

Les cellules endothéliales (CE) constituent la paroi interne des vaisseaux sanguins et sont essentielles à la régulation de l'homéostasie vasculaire, ainsi qu'au maintien d'un phénotype de vaisseau anti-inflammatoire et anticoagulant1. Dans les troubles vasculaires, cette homéostasie est perturbée en raison d'un dysfonctionnement endothélial2,3 qui entraîne une perte d'intégrité vasculaire et une perméabilité accrue4, une libération réduite d'agents vasoactifs tels que l'oxyde nitrique (NO)5, ainsi que des modifications de la thrombogénicité6 et de l'expression de la surface molécules d'adhésion qui influencent les interactions leucocytaires7,8. La dysfonction endothéliale est fortement associée à la perte du glycocalyx endothélial, une couche protectrice de protéines et de sucres qui recouvre la surface luminale des CE9. Les principaux composants du glycocalyx endothélial sont des protéoglycanes, comme les syndécanes, riches en chaînes latérales de glycosaminoglycanes, comme l'héparane sulfate (HS)10. De nombreuses protéines plasmatiques régulatrices, comme l'antithrombine III (ATIII), l'inhibiteur de C1 ou le facteur H ont des domaines de liaison HS11,12,13 à travers lesquels elles interagissent avec le glycocalyx. La liaison du facteur H, protéine régulatrice du complément, aux surfaces cellulaires via les glycosaminoglycanes est cruciale pour protéger contre une activation excessive du complément14. D'autre part, la liaison de l'ATIII au glycocalyx endothélial renforce son activité inhibitrice vis-à-vis de la protéine de coagulation Facteur XIa, bloquant ainsi l'activation de la cascade de coagulation15. De plus, il a été suggéré que le glycocalyx forme un bouclier non adhérent à la surface des CE qui inhibe l'adhésion excessive des leucocytes, réduisant ainsi la transmigration des leucocytes et l'inflammation des tissus16. Ainsi, le glycocalyx endothélial, en particulier HS, joue un rôle crucial dans la régulation de l'homéostasie vasculaire en maintenant un environnement anti-inflammatoire et anticoagulant. La perte du glycocalyx endothélial a été décrite dans de nombreux troubles17. Par exemple, la dysfonction endothéliale concomitante à des facteurs de risque cardiovasculaires tels que l'hypertension, le diabète et l'obésité est directement liée à la perte de glycocalyx endothélial de la surface cellulaire, à l'augmentation des événements thrombotiques et à la progression de la maladie18.

L'excrétion du glycocalyx se produit également pendant la transplantation, où elle est associée à une faible survie du greffon et au rejet des tissus19. Cela est en partie dû aux niveaux élevés de la cytokine pro-inflammatoire TNFα20,21 qui régule à la hausse les enzymes protéolytiques, telles que l'héparanase et la métalloprotéinase matricielle 9 (MMP9), qui clivent les protéoglycanes et le HS de la surface cellulaire, provoquant une perturbation de l'intégrité vasculaire et un rejet vasculaire22,23. Récemment, faute de donneurs d'organes humains, la recherche s'est concentrée sur la xénotransplantation, la transplantation de tissus ou d'organes entre deux espèces différentes. Les porcs sont actuellement considérés comme le donneur d'organes le plus prometteur. Dans la xénotransplantation, les anticorps préformés du receveur, ciblant les résidus de sucre à la surface des EC porcins donneurs, induisent la perte de glycocalyx, le dépôt de complément et le dysfonctionnement endothélial, aboutissant finalement au rejet d'organe24,25,26.

Outre la xénotransplantation, une autre affection inflammatoire dans laquelle la perte de glycocalyx endothélial est considérée comme une caractéristique de la maladie est la septicémie. Là, la quantité de composants du glycocalyx libérée des CE et mesurée dans le plasma est en corrélation avec le développement de la coagulation intravasculaire disséminée27 et la survie réduite du patient28.

Bien qu'il ait été démontré que les conditions inflammatoires endommagent le glycocalyx et initient ou propagent la maladie, on ne sait pas si le glycocalyx sur les EC de divers lits vasculaires réagit différemment aux insultes inflammatoires et si cela a un impact sur le comportement de l'EC. Des différences physiopathologiques dans l'état d'hypercoagulabilité des cellules artérielles et veineuses ont été décrites29. Les CE de la veine cave inférieure par rapport aux CE aortiques régulent fortement à la hausse l'expression des molécules d'adhésion en réponse à la cytokine pro-inflammatoire TNFα30. On ne sait toujours pas si cette hétérogénéité entre les EC est due à des différences dans le motif du glycocalyx à la surface des cellules et si cela conduit à un dysfonctionnement endothélial plus fort dans les veines par rapport à l'aorte. Nous émettons l'hypothèse que les différences dans la dynamique du glycocalyx influencent l'interaction de l'endothélium avec les protéines régulatrices conduisant à des réponses distinctes dans différents lits vasculaires.

Pour déterminer si la dynamique du glycocalyx est différente pour les cellules artérielles et veineuses, nous comparons le modèle d'expression du glycocalyx sur les CE artériels et veineux primaires porcins à l'aide d'un système microfluidique 3D à canal rond. Nous nous concentrons sur l'analyse du rôle de HS, l'acteur principal dans le maintien des fonctions physiologiques du glycocalyx11, dans des conditions statiques ou de flux, et lors de la stimulation avec plusieurs stimuli inflammatoires tels que le sérum humain, pour mimer un contexte de xénotransplantation, le TNFα et le LPS. L'interaction entre le glycocalyx et le dysfonctionnement endothélial a été analysée en évaluant l'activation du complément, l'adhésion leucocytaire et l'activation de la cascade de coagulation.

Des CE macrovasculaires primaires ont été isolées de l'aorte thoracique porcine et de la veine cave obtenues à partir de porcs femelles et mâles de races locales âgés de 4 à 8 mois après l'euthanasie. Conformément aux principes des 3R, les récipients ont été obtenus à partir d'animaux utilisés pour des expériences terminales par d'autres groupes de recherche au sein de l'Université de Berne. Pour ces animaux, une anesthésie générale a été réalisée avec du propofol (1–4 mg/kg) et de la kétamine (1 mg/kg), maintenue avec du propofol (2–8 mg/kg/h) et du fentanyl (5–30 g/kg/h ) et une analgésie supplémentaire a été fournie avec de la ropivacaïne (0,5 %) et de la morphine (0,1 mg/kg). La mort de l'animal a été définie soit comme le retrait du cœur du corps, soit lorsque le signal EEG est resté stable pendant au moins 60 s après l'administration de rocuronium et l'arrêt de la ventilation mécanique. Les expérimentations animales et l'euthanasie ont été réalisées conformément aux réglementations fédérales suisses et approuvées par l'Office vétérinaire cantonal de Berne, Suisse. Les CE artérielles ont été récoltées mécaniquement à partir de la lumière de l'aorte à l'aide d'un coton-tige humidifié, tandis que les CE veineuses ont été récoltées à partir de la veine cave par digestion enzymatique à l'aide de collagénase II (Worthington LS004174, 1,88 U/ml dans du DMEM pur). Les cellules ont été cultivées dans des milieux complets (DMEM Glutamax, Gibco 21885-025) avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS, Sigma F7542) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S, Gibco 15140-122) additionné de 1 % de sérum endothélial. mélange de supplément de milieu de croissance 2 (PromoCell C-39216) et surveillé quotidiennement pour éviter la prolifération de fibroblastes. À la confluence, les cellules ont été phénotypées, cryoconservées et stockées pour de futures expériences. Les cellules ont été phénotypées par coloration pour les marqueurs EC CD31 et le facteur von Willebrand ainsi que l'actine musculaire lisse α pour vérifier la pureté. Seules les cultures exprimant à la fois les marqueurs EC et moins de 10 % d'actine musculaire lisse α ont été utilisées. Les cellules ont été utilisées exclusivement jusqu'au passage quatre pour éviter la dérive phénotypique. Pour toutes les expériences, les EC d'au moins 2 donneurs différents de porc ont été utilisés.

Des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été fraîchement isolées à partir de sang total anticoagulé sur EDTA humain ou porcin par centrifugation de densité. Des échantillons de sang humain ont été obtenus auprès de volontaires sains avec un consentement éclairé et anonymisés immédiatement après le don. Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique local du canton de Berne et les expériences ont été réalisées conformément aux réglementations fédérales suisses et aux directives de l'Université de Berne. Pour l'isolement des PBMC, le sang a d'abord été centrifugé pour éliminer le plasma, qui a ensuite été remplacé par des quantités égales de PBS-2 % FBS. Le sang dilué a été étalé sur un milieu de centrifugation à gradient de densité Ficoll-Paque (Cytivia 17144002) et les PBMC ont été isolés selon le protocole du fabricant. Ensuite, les PBMC ont été lavés avec du PBS-2% FBS. Les PBMC humains ont été utilisés fraîchement après isolement, tandis que les PBMC porcins ont été congelés dans du FBS avec 10 % de DMSO (diméthylsulfoxyde, Sigma D4540-100ML) pour une utilisation ultérieure.

Des puces microfluidiques en polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant des canaux 3D à section ronde d'un diamètre de 550 μm ont été préparées comme décrit précédemment31. Les canaux microfluidiques ont été recouverts de 50 μg/ml de fibronectine (Merck FC010) et 100 μg/ml de collagène II (Gibco A10644-01). Les CE artérielles et veineuses ont ensuite été ensemencées (1 million de cellules/ml) dans un milieu de circulation (DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de P/S, 4 % de dextran, Sigma 31390-100G et 1 % d'albumine de sérum bovin, Sigma A7030-100G) et laisser adhérer une nuit à 37°C. Une fois confluent, chaque canal était relié à une pompe péristaltique (Gilson minipuls 3). À l'aide d'un tube en silicone, le fluide d'écoulement a été extrait d'un réservoir et passé à travers un piège à bulles avant d'atteindre les cellules. La pompe péristaltique a été ajustée pour générer une contrainte de cisaillement laminaire de 2 dyn/cm2 ou 12 dyn/cm2 (viscosité du milieu μ = 2,1 mPa s) pendant 72 h. Les puces microfluidiques ont été maintenues dans un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5 % de CO2. Les milieux ont été changés toutes les 24 h pour fournir des nutriments frais.

Pour les canaux microfluidiques, les cellules ont été cultivées pendant 72 h sous flux ou dans des conditions statiques, puis fixées avec du formaldéhyde à 4 % (solution mère Sigma 252549-500ML 37 %) pendant 20 min à température ambiante. Après blocage pendant une heure à température ambiante avec du PBS-3%BSA, les cellules ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps anti-héparane sulfate (Amsbio 370-255-1, clone F58-10E4), une lectine d'agglutinine de germe de blé (WGA) (Sigma L4895-2MG) pour colorer la N-acétylglucosamine (GlcNAc) et l'acide sialique, l'anticorps anti-CD31 porcin (R&D MAB33871) et/ou le composant polyclonal anti-complément humain C3b/c (DAKO A0062) dilué dans du PBS-1%BSA -0,05 % de Tween (Tween 20, AppliChem A4974,0250). Par la suite, les échantillons ont été incubés pendant 1,5 h sous agitation à température ambiante avec des anticorps secondaires : chèvre anti souris IgM AlexaFluor568 (Invitrogen A21043) ou chèvre anti souris IgM AlexaFluor488 (Invitrogen A21042) pour l'héparane sulfate, chèvre anti rat IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21094) ou chèvre anti rat IgG AlexaFluor568 (Invitrogen A11077) pour CD31 et/ou chèvre anti lapin IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21071) pour C3b/c. Tous les anticorps secondaires ont été dilués dans du PBS-1 % BSA-0,05 % Tween. Le DAPI (Simga, 32670-20MG-F) a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires. Les puces microfluidiques ont ensuite été lavées et imagées à l'aide d'un objectif 20 × sur un microscope confocal Zeiss LSM710 AxioObserver ou Zeiss LSM980 et analysées à l'aide de l'image J (version 2.3.0/1.53q). La coloration GlcNAc/acide sialique et HS a été analysée en quantifiant la couverture selon une méthode adaptée de Cheng et al.32. Pour la quantification, le seuil de fluorescence a été ajusté pour réduire le bruit de fond et l'image a été convertie en un masque noir et blanc. ImageJ a été utilisé pour mesurer le pourcentage de zones blanches par rapport à la zone du canal et ce pourcentage a été assimilé à la couverture du glycocalyx, qui a été normalisée au nombre de cellules par canal. Au moins trois images ont été analysées par échantillon. Pour les lames de chambre, utilisées pour caractériser les CE cultivées, la même procédure que celle décrite ci-dessus a été utilisée. Les lames ont ensuite été montées à l'aide du réactif antifade ProLong Gold (Invitrogen P36934) et acquises avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 20 × (Leica DMI4000B).

Des vaisseaux en face ont été préparés à partir d'aorte thoracique porcine et de veine cave fraîchement isolées qui ont été coupées en morceaux de 1 cm2 et fixées avec du formaldéhyde à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Les morceaux de vaisseau ont ensuite été bloqués et colorés pour le facteur von Willebrand (DAKO A0082), le CD31 et les composants du glycocalyx comme décrit ci-dessus. Les images ont été acquises avec un microscope confocal (Zeiss AxioObserver LSM710).

Pour obtenir des coupes de vaisseaux, des anneaux d'aorte thoracique porcine et de veine cave fraîchement isolées ont été inclus dans le composé TissueTek OCT (Sakura 4583). Des sections de 5 μm d'épaisseur ont été fixées avec de l'acétone froide à 100% (AppliChem 141007.1211) et incubées pendant 30 min avec du NHS à 20% dilué dans du TBS pour induire l'excrétion de HS et le dépôt de complément. Les coupes témoins ont été incubées avec du TBS uniquement. Les cryosections ont été bloquées avec du TBS-BSA à 3 %, colorées et montées comme décrit ci-dessus. Les images ont été acquises avec un microscope confocal à un grossissement de 20 × (Zeiss LSM980). Pour imager le glycocalyx sur des cellules vivantes non fixées, des canaux microfluidiques ont été perfusés pendant 72 h (2 dyn/cm2 ou 12 dyn/cm2) puis colorés pendant 30 min sous flux avec WGA-Lectine et coloration nucléaire Hoechst en utilisant les dilutions décrites ci-dessus en flux médias sans FBS. Les canaux ont été immédiatement imagés à l'aide d'un microscope confocal à un grossissement de 20 × (Zeiss LSM980).

Après 72 h de contrainte de cisaillement élevée (12 dyn/cm2), les cellules ont été laissées non traitées ou incubées sous flux avec du sérum humain normal à 10 % (prélevé sur des volontaires sains) pendant 2 h, 100 ng/ml de facteur de nécrose tumorale humain recombinant α (TNFα , R&D 210-TA), 100 μg/ml de lipopolysaccharide (LPS, Sigma L4391) ou 5 U/ml d'héparinase I + III (Sigma H3917-100UN) pendant 4 h à 37 °C dans un milieu sans sérum. Pour évaluer le dépôt de complément sur les cellules stimulées par le TNFα, le LPS et l'héparinase I + III, les canaux ont en outre été perfusés avec du sérum porcin à 10 % au cours des 2 dernières heures d'activation. Après fixation, les échantillons ont été colorés en utilisant un anticorps anti-complément C3b/c comme décrit ci-dessus.

Les cellules ont été ensemencées dans des canaux microfluidiques à section ronde 3D et perfusées pendant 72 h dans des conditions de contrainte de cisaillement de 12 dyn/cm2, après quoi elles ont été traitées avec du sérum humain normal, du TNFα humain recombinant, du LPS ou de l'héparinase I + III comme décrit ci-dessus. Les noyaux des CE dans les canaux ont été colorés sous flux avec la coloration nucléaire Hoechst 3342 (Tocris 23491-52-3). Ensuite, des PBMC isolés humains ou porcins ont été marqués avec du CFSE (ThermoFisher C34554) conformément aux instructions du fabricant et remis en suspension dans un milieu d'écoulement sans dextran. Chaque canal a été perfusé à une contrainte de cisaillement de 0,2 dyn/cm2 avec 1 million/ml de PBMC marqués tandis que les images étaient acquises toutes les 3 s pendant 20 min. Des fichiers vidéo avec une fréquence d'images de 3 images par seconde ont été créés pour analyse. L'adhésion des PBMC a été définie comme le nombre de cellules immobilisées pendant au moins 3 s (c'est-à-dire une trame). Les cellules ont été comptées manuellement pour chaque enregistrement time-lapse. Les canaux ont été fixés après perfusion de PBMC et colorés pour HS comme décrit ci-dessus.

Les cellules ont été ensemencées dans des canaux microfluidiques à section ronde 3D comme décrit ci-dessus, puis perfusées à une contrainte de cisaillement de 12 dyn/cm2 avec du plasma de citrate humain recalcifié (provenant de volontaires sains anonymes) ou porcin (Merck P2891) additionné de 15 μg/ml d'AF488 marqué fibrinogène humain (Thermofisher F13191). Le plasma enrichi en fibrinogène a été recalcifié par addition de CaCl2 25 mM (plasma humain) ou 13 mM (plasma porcin) (Sigma 10043-52-4) immédiatement avant l'imagerie. Pendant la perfusion, les cellules ont été imagées toutes les 5 s pendant jusqu'à 15 min à l'aide d'un microscope confocal (Zeiss LSM980). L'expérience a pris fin lorsqu'une occlusion complète du canal s'est produite ou lorsque l'occlusion du canal a provoqué une augmentation de la pression dans le système microfluidique conduisant à un détachement cellulaire complet de la surface du canal. Le temps d'occlusion a été déterminé à partir de fichiers vidéo avec une fréquence d'images de 3 images par seconde.

Tous les ensembles de données ont été analysés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9, et p < 0,05 a été considéré comme significatif. Une ANOVA unidirectionnelle suivie de comparaisons multiples à l'aide du test t de Tukey par paires a été effectuée pour les ensembles de données comportant plus de 2 groupes. Pour le dépôt de complément, l'adhésion PBCM et la coagulation ANOVA bidirectionnelle ont été effectuées, suivies de multiples comparaisons à l'aide de l'analyse post-hoc de Tukey et Bonferroni. Les expériences ont été réalisées avec un minimum de trois répétitions biologiques.

Pour déterminer comment la contrainte de cisaillement affecte l'expression des différents composants du glycocalyx et déterminer si le glycocalyx pourrait expliquer le comportement diversifié des EC artériels et veineux lors de troubles inflammatoires, nous avons analysé la couverture du glycocalyx à la surface de l'EC par immunofluorescence. Les cellules veineuses et artérielles ont été cultivées pendant 72 h dans des conditions de contrainte de cisaillement statique ou laminaire (12 dyn/cm2 et 2 dyn/cm2) dans un système microfluidique à canal rond 3D31. Ces conditions de contrainte de cisaillement ont été choisies en fonction des valeurs de contrainte de cisaillement physiologiques pour l'aorte et la veine cave rapportées à partir de données in vivo 33. Les cellules ont été colorées à l'aide de lectine d'agglutinine de germe de blé (WGA), qui se lie à la N-acétylglucosamine (GlcNAc) et à l'acide sialique ( Sia) présents dans le glycocalyx endothélial. La coloration WGA a été largement utilisée pour étiqueter, visualiser et quantifier spécifiquement le glycocalyx sur l'endothélium vasculaire34,35. Comme le montre la Fig. 1A – D, la coloration WGA (GlcNAc, Sia) a été principalement observée lors d'une contrainte de cisaillement laminaire sur les EC artériels et veineux. D'autre part, HS, le composant majeur du glycocalyx exprimé par les EC responsables du maintien des propriétés anti-inflammatoires et anticoagulantes physiologiques, était dépendant du flux des cellules artérielles (Fig. 1E, F), alors que, de manière surprenante, HS était déjà observé dans des conditions statiques. à la surface des EC veineux (Fig. 1G,H). Cela indique que la dynamique du glycocalyx diffère entre les cellules artérielles et veineuses. De plus, les changements de contrainte de cisaillement ont influencé la distribution de HS. Dans des conditions de faible cisaillement (2 dyn/cm2), le HS était situé le long des régions jonctionnelles des CE, tandis que lorsqu'une contrainte de cisaillement élevée était appliquée, le HS se regroupait dans des zones distinctes de la membrane cellulaire (Fig. 1E, G). Il a été démontré que le regroupement de protéoglycanes contenant HS, comme le syndécan-4, se produit dans des régions spécifiques du radeau lipidique membranaire et est important pour le trafic vésiculaire et la transduction du signal36.

Influence de la contrainte de cisaillement sur la couverture du glycocalyx/N-acétylglucosamine, de l'acide sialique et de l'héparane sulfate sur les cellules endothéliales artérielles et veineuses. Images représentatives de canaux microfluidiques contenant des cellules endothéliales porcines artérielles (A, E) ou veineuses (C, G) cultivées dans des conditions statiques, à faible (2 dyn/cm2) ou à forte contrainte de cisaillement (12 dyn/cm2). Les cellules ont été colorées (A, C) pour la N-acétylglucosamine (GlcNAc) et l'acide sialique (Sia) en vert ou (E, G) pour le sulfate d'héparane (HS) en rouge. Les noyaux sont représentés en bleu (DAPI). Toutes les images ont été acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM710. Barre d'échelle : 50 μm. (B,D,F,H) La couverture des composants du glycocalyx (GlcNAc/Sia ou HS) a été calculée pour chaque image (4 images/condition/expérience) en pourcentage de la zone positive pour (B,D) GlcNAc et Sia ou (F ,H) pour HS et, a été normalisé au nombre total de cellules/image. Les données proviennent d'au moins trois expériences indépendantes et de 2 à 3 donneurs d'EC porcins différents. Une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples a été utilisée pour l'analyse statistique.

Pour s'assurer que les EC in vitro ont un phénotype similaire à celui des EC in vivo, l'aorte thoracique porcine et la veine cave fraîchement isolées ont été colorées en face avec des marqueurs EC, tels que CD31 et vWF (von Willebrand Factor), et pour le glycocalyx, avec les deux WGA lectine et anticorps anti-HS. Comme le montre la Fig. S1 supplémentaire, les CE cultivées in vitro présentent un phénotype similaire aux CE in vivo dans les vaisseaux sanguins.

Les altérations du glycocalyx et l'excrétion de HS entraînent une perte de liaison aux protéines et sont observées lors d'une lésion de reperfusion ischémique et d'une transplantation. Actuellement, en raison de la pénurie mondiale d'organes, la transplantation d'organes entre deux espèces différentes est fortement envisagée37.

Par conséquent, pour déterminer si la différence de dynamique du glycocalyx entre les cellules artérielles et veineuses induirait des réponses distinctes au cours d'une condition inflammatoire telle que la xénotransplantation, les CE artérielles et veineuses porcines ont été perfusées avec du sérum humain normal (NHS) pour imiter in vitro un environnement de xénotransplantation. Il a été démontré que la liaison d'anticorps xénoréactifs préformés à des xénoantigènes exprimés à la surface de l'EC, tels que l'α-galactose24 induit la perte du glycocalyx EC38 conduisant au rejet du greffon. Nous avons observé l'excrétion de HS de la surface des EC artériels stimulés par le NHS (Fig. 2A, B; (-) et sérum). Ceci était corrélé à une expression accrue de la sélectine E (Fig. S2A supplémentaire; (-) et sérum), une molécule d'adhésion importante responsable en partie de l'interaction des CE avec les leucocytes. Étonnamment, la stimulation des EC veineux avec le NHS n'a pas induit d'excrétion de HS ; une couverture HS de 16 à 18% a été observée sur les CE activées et non activées (Fig. 2C, D; (-) et sérum). Cependant, comme pour les EC artériels, l'expression de la sélectine E a été augmentée après incubation avec le NHS (Fig. S2B supplémentaire). Pour s'assurer que le HS peut effectivement être éliminé de la surface des cellules veineuses, les CE ont été perfusées avec de l'héparinase I + III, une enzyme qui clive spécifiquement le HS. Comme observé sur les Fig. 2A, C, l'incubation avec de l'héparinase élimine environ 50 % (Fig. 2B) et 70 % (Fig. 2D) de HS des cellules artérielles et veineuses, respectivement. D'autres composants du glycocalyx tels que le GlcNAc et l'acide sialique n'ont pas été affectés par le NHS (Fig. S3A, B supplémentaire) ni, comme prévu, par le traitement à l'héparinase (Fig. S3C supplémentaire).

La résistance à l'excrétion de sulfate d'héparane sur les cellules veineuses activées xénogéniques n'empêche pas le dépôt de C3b/c. (A, C) Images représentatives du sulfate d'héparane (HS) sur la surface cellulaire des cellules non traitées (-), perfusées avec 10 % de sérum humain normal (sérum) ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). HS est représenté en rouge et les noyaux en bleu (DAPI). Barre d'échelle : 50 μm (B, D) La perte de HS a été quantifiée pour chaque image (4 images/condition/expérience) en pourcentage de surface positive pour HS et normalisée pour le nombre total de cellules/image. (E, G) Images représentatives du dépôt de complément C3b/c sur la surface cellulaire des cellules laissées non traitées (-), perfusées avec 10 % de sérum humain normal (sérum) ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). C3b/c est représenté en jaune et les noyaux en bleu (DAPI). Barre d'échelle : 50 μm (F, H) Le dépôt de C3b/c a été mesuré en pourcentage de cellules positives pour C3b/c/nombre total de cellules/image (4 images/condition/expérience). Les données ont été quantifiées avec le logiciel Fiji. Toutes les images ont été acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM980. Les données proviennent d'au moins trois expériences indépendantes et de 2 à 3 donneurs d'EC porcins différents. Une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples a été utilisée pour l'analyse statistique.

Pour confirmer que nos observations ne se limitent pas seulement aux CE en culture, des cryosections d'aorte thoracique porcine et de veine cave fraîchement isolées ont été traitées ex vivo avec du NHS et analysées pour la couverture HS. Encore une fois, l'excrétion de HS de l'artère mais pas de la veine a été observée (Fig. S4 supplémentaire). De plus, pour exclure d'éventuels artefacts dans la couverture du glycocalyx dus à la fixation, une coloration GlcNAc/Sia a été réalisée sur des cellules vivantes non fixées. Comme le montre la Fig. S5 supplémentaire, la couverture de GlcNAc / Sia est comparable sur les EC artériels et veineux vivants et fixes dans des conditions de contrainte de cisaillement faible et élevée. De plus, pour s'assurer que la contrainte de cisaillement élevée utilisée dans la configuration expérimentale n'interférait pas avec l'excrétion de HS des EC veineux, qui nécessitent normalement un environnement de cisaillement inférieur, la perfusion de NHS a été réalisée dans des conditions de contrainte de cisaillement veineux (2 dyn/cm2) . Une fois de plus, HS n'a été éliminé que de la surface des cellules artérielles (Fig. Supplémentaire S6A – D).

L'excrétion de HS a été liée à un phénotype EC pro-inflammatoire susceptible de compléter le dépôt, l'adhésion des leucocytes et la coagulation.

Le dépôt de complément sur les cellules artérielles et veineuses a été évalué par immunofluorescence après perfusion des cellules avec du NHS à une contrainte de cisaillement de 12 dyn/cm2. Le choix d'une contrainte de cisaillement plus élevée était basé sur l'observation que le cisaillement peut améliorer l'expression des récepteurs du complément sur les CE et permettre une meilleure visualisation du dépôt de complément39. Les trois voies de la cascade du complément activé fusionnent au niveau de C3, un composant essentiel du système du complément où se produit l'amplification du signal40. Par conséquent, le dépôt de C3b/c, le produit du clivage de C3 par les enzymes convertase C3 du complément, a été utilisé comme marqueur pour l'activation du complément. Fait intéressant, bien que l'excrétion du glycocalyx endothélial n'ait été observée qu'à partir de cellules artérielles activées par le NHS (Fig. 2A – D), un dépôt de complément C3b / c a été observé sur les deux types de cellules (Fig. 2E – H), indiquant que la persistance de HS sur les cellules veineuses ne protège pas contre le dépôt de complément. Pour déterminer si l'élimination de HS augmenterait le dépôt de complément, les cellules ont été traitées avec de l'héparinase. La liaison de C3b / c aux cellules artérielles et veineuses n'a pas augmenté par rapport aux cellules stimulées par le NHS (Fig. 2E – H), confirmant que le HS sur les cellules veineuses ne joue pas de rôle dans la régulation du dépôt de complément dans une configuration de xénotransplantation.

Pour déterminer si le dépôt de complément sur la surface cellulaire favorise l'excrétion de HS, les canaux ont été perfusés avec du NHS inactivé par la chaleur (sérum HI). La chaleur bloque l'activation du système du complément, donc seul un dépôt minimal de C3b/c est attendu. L'incubation de cellules artérielles et veineuses avec du NHS inactivé par la chaleur n'a pas induit d'excrétion de HS (Fig. Supplémentaire S7A – D) et de dépôt de C3b / c (Fig. Supplémentaire S7E – H). Cela démontre que l'excrétion de HS par les cellules artérielles pourrait être considérablement réduite en inactivant le système du complément, ce qui suggère que le dépôt de complément sur les cellules artérielles est en corrélation avec l'excrétion de HS.

Ensuite, nous avons évalué la liaison des PBMC humains aux EC porcins activés xénogéniques. L'adhérence des PBMC a été quantifiée comme le nombre de leucocytes qui se lient à la surface cellulaire pendant au moins 3 s. Une quantité similaire de liaison de PBMC aux cellules artérielles et veineuses a été détectée (Fig. 3A – C). Comme le montre la Fig. S2 supplémentaire, la sélectine E est exprimée à la fois sur les cellules artérielles et veineuses après perfusion avec NHS.

La persistance de sulfate d'héparane sur les cellules veineuses après activation xénogénique ne parvient pas à empêcher l'adhésion des leucocytes et la formation de caillots. (A,B) Images représentatives de 3 enregistrements en accéléré de la liaison des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC; illustrées en vert) aux cellules endothéliales porcines artérielles (A) et veineuses (B) laissées non traitées (-) ou perfusées avec l'un ou l'autre 10 % de sérum humain normal (sérum) ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). Les noyaux des cellules sont représentés en bleu (Hoechst). Barre d'échelle : 50 μm. (C) Les PBMC adhérents ont été quantifiés à partir d'enregistrements accélérés de 20 min de quatre expériences indépendantes en comptant les cellules immobilisées pendant ≧ 3 s. (D,E) Images représentatives de caillots de fibrine (vert) se formant sur (D) artériel ou (E) CE porcin veineux. Les cellules ont été laissées non traitées (-) ou perfusées avec 10 % de sérum humain normal (sérum) ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase) avant l'ajout de plasma humain citraté recalcifié dopé avec du fibrinogène humain marqué AlexaFluor488 (vert). Barre d'échelle : 200 μm. (F) Le temps d'occlusion a été déterminé comme une occlusion complète du canal ou un détachement cellulaire et quantifié à partir d'enregistrements accélérés de canaux perfusés au plasma. Les données proviennent de quatre expériences indépendantes, de 2 à 3 donneurs d'EC porcins différents et ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji. L'ANOVA bidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey et Bonferroni a été utilisée pour l'analyse statistique.

Pour déterminer si l'excrétion de HS en l'absence d'un stimulus inflammatoire provoque la liaison des leucocytes, les CE ont été traitées avec de l'héparinase. L'héparinase n'active pas les CE, en fait, aucune sélectine E n'a été exprimée à la surface cellulaire de l'un ou l'autre type de cellule (Fig. S2 supplémentaire). De manière inattendue, l'excrétion de HS à partir de cellules artérielles mais non veineuses traitées à l'héparinase était suffisante pour induire l'adhésion de PBMC humains (Fig. 3C). Cela indique que l'expression de la sélectine E est essentielle pour la liaison des leucocytes aux EC veineux, tandis que HS influence l'adhésion des PBMC aux EC artériels.

Nous avons ensuite analysé l'impact de l'excrétion de HS sur la formation de caillots en perfusant des cellules artérielles et veineuses avec du plasma humain recalcifié dopé avec du fibrinogène humain marqué par fluorescence. Comme le montre la Fig. 3D – F, le temps nécessaire à la formation de caillots des EC artériels et veineux activés avec le NHS a été réduit d'environ 50 % et 40 %, respectivement, par rapport aux cellules non traitées (Fig. 3F), ce qui implique que le HS intact sur la veine veineuse cellules n'empêche pas la coagulation. Fait intéressant, les cellules artérielles non traitées ont eu un temps de formation de caillots de 8 minutes alors que les canaux contenant des cellules veineuses se sont déjà obstrués après 5 minutes (Fig. 3F). Cela indique qu'il existe une différence fondamentale dans le temps de coagulation entre ces deux types de cellules.

Pour étudier plus avant le rôle de HS dans la coagulation, les cellules ont été traitées avec de l'héparinase avant la perfusion avec du plasma humain dopé en fibrinogène. Comme le montre la Fig. 3D – F, alors que l'excrétion de HS réduisait le temps d'occlusion pour les canaux ensemencés avec des EC artériels, aucun effet n'a été observé sur les cellules veineuses. Ceci suggère que l'élimination de HS des cellules artérielles est suffisante pour induire un phénotype procoagulant.

Pour déterminer si les cellules veineuses sont résistantes à l'excrétion de HS également dans différentes conditions pro-inflammatoires, nous avons stimulé les CE avec du TNFα et du LPS et mesuré la couverture de HS comme décrit ci-dessus. L'excrétion de HS a été observée pour les EC artériels activés par le TNFα et le LPS (Fig. 4A, B), mais encore une fois pas pour les EC veineux activés (Fig. 4C, D). En fait, HS a été réduit à la surface cellulaire des cellules artérielles traitées au TNFα et au LPS de 41% et 30% respectivement, par rapport au témoin (Fig. 4B), alors qu'il était inchangé à la surface des EC veineux (Fig. 4D).

Le sulfate d'héparane indemne sur les cellules veineuses après stimulation avec du TNFα ou du LPS empêche le dépôt de complément. (A, C) Images représentatives de cellules laissées non traitées (-) ou perfusées avec 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). L'héparane sulfate (HS) est représenté en rouge et les noyaux en bleu (DAPI). Barre d'échelle : 50 μm. (B, D) La perte de HS a été quantifiée pour chaque image (4 images/condition/expérience) en tant que pourcentage de zone positive pour HS et normalisée pour le nombre total de cellules/image. (E, G) Images représentatives du complément C3b/c sur la surface cellulaire des cellules non traitées (-) ou perfusées avec 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). C3b/c est représenté en jaune et les noyaux en bleu (DAPI). Barre d'échelle : 50 μm (F, H) Le dépôt de C3b/c a été mesuré en pourcentage de cellules positives pour C3b/c/nombre total de cellules/image (4 images/condition/expérience). L'ANOVA bidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey et Bonferroni a été utilisée pour l'analyse statistique. Les données proviennent de trois expériences indépendantes ou plus, de 2 à 3 donneurs de CE porcins différents et ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji.

Pour évaluer si la persistance de HS sur la surface de la CE permettrait aux cellules de maintenir un phénotype anti-inflammatoire, les CE ont été perfusées avec du sérum porcin normal (NPS) et le dépôt de complément a été évalué. Comme observé sur la figure 4E – H, une petite quantité de C3b / c a été détectée à la surface des CE non stimulées. Cela est probablement dû à l'inadéquation immunologique entre les CE et les NPS obtenus de différents donneurs. La stimulation des cellules artérielles avec du TNFα ou du LPS a augmenté le dépôt de C3b / c d'environ 25% et 30%, respectivement (Fig. 4F), confirmant que l'excrétion de HS des cellules artérielles est corrélée à une perte de propriétés anti-inflammatoires. D'autre part, la perfusion de cellules veineuses activées par le TNFα ou le LPS avec du NPS n'a pas entraîné de dépôt de complément (Fig. 4H), ce qui suggère que dans ces conditions inflammatoires, le HS sur les cellules veineuses est protecteur. Pour confirmer davantage le rôle protecteur de HS, les EC artériels et veineux ont été perfusés avec de l'héparinase. Comme le montre la Fig. 4, l'élimination enzymatique de HS par l'héparinase (Fig. 4A – C) de la surface cellulaire était suffisante pour induire le dépôt de C3b / c sur les EC artériels et veineux (Fig. 4F, H).

Ensuite, nous avons étudié si la différence observée dans la dynamique HS entre les cellules artérielles et veineuses activées par le TNFα et le LPS aurait un impact sur leur interaction avec les leucocytes. Pour cela, des EC artériels et veineux activés par TNFα ou LPS ont été perfusés avec des PBMC porcins marqués par fluorescence. Une liaison accrue des PBMC a été observée pour les CE artérielles et veineuses activées (Fig. 5A – C). Ceci était en corrélation avec l'expression de la surface cellulaire de la sélectine E (Fig. S2B supplémentaire). Ensemble, cela suggère que bien que HS ne soit pas éliminé de la surface des EC veineux (Fig. 2C, D), l'expression accrue de la sélectine E est suffisante pour permettre l'adhésion des PBMC. En effet, l'excrétion de HS par l'héparinase avant la perfusion de PBMC sur les cellules veineuses n'a pas augmenté l'adhérence des PBMC, alors que sur les cellules artérielles, l'élimination de HS sans activation préalable était suffisante pour induire la liaison des PBMC (Fig. 5A, C).

Le sulfate d'héparane intact sur les cellules endothéliales veineuses activées par le TNFα ou le LPS n'empêche pas l'adhésion des leucocytes mais protège contre la formation de caillots. (A, B) Images représentatives de trois enregistrements en accéléré de la liaison des cellules mononucléaires du sang périphérique porcin (PBMC; illustrées en vert) aux cellules endothéliales porcines artérielles (A) et veineuses (B) laissées non traitées (-) ou perfusées avec l'un ou l'autre 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS ou 5 U/ml d'héparinase (Heparinase). Les noyaux des cellules sont représentés en bleu (Hoechst). Barre d'échelle : 50 μm. (C) Les PBMC adhérents ont été quantifiés à partir d'enregistrements accélérés de 20 min de quatre expériences indépendantes en comptant les cellules immobilisées pendant ≧ 3 s. (D,E) Images représentatives de caillots de fibrine (vert) se formant sur (D) artériel ou (E) veineux cellules endothéliales porcines. Les cellules ont été laissées non traitées (-) ou perfusées avec 100 ng/ml de TNFα, 100 μg/ml de LPS ou 5 U/ml d'héparinase (héparinase). Les noyaux des cellules sont représentés en bleu (Hoechst). Barre d'échelle : 200 μm. (F) Le temps d'occlusion a été déterminé comme une occlusion complète du canal ou un détachement cellulaire et quantifié à partir d'enregistrements accélérés de canaux perfusés au plasma dopés avec du fibrinogène marqué AlexaFluor488 (vert). Les données proviennent de quatre expériences indépendantes, de 2 à 3 donneurs d'EC porcins différents et ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji. (C) ANOVA bidirectionnelle avec test post-hoc de Tukey et Bonferroni ou (F) ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples a été utilisée pour l'analyse statistique.

Étant donné que la persistance de HS sur les cellules veineuses après stimulation avec du TNFα ou du LPS était capable de protéger contre le dépôt de complément, nous avons recherché si la formation de caillots serait également altérée. Pour cela, les cellules veineuses et artérielles ont été laissées non traitées ou activées avec du TNFα, du LPS ou de l'héparinase, puis perfusées avec un pool de plasma porcin normal recalcifié dopé avec du fibrinogène marqué par fluorescence AlexaFluor488. Comme le montre la Fig. 5D – F, le temps de formation du caillot n'a été réduit que pour les EC artériels mais pas pour les EC veineux (Fig. 5F). Ceci indique que l'HS sur les cellules veineuses participe au maintien d'un état anticoagulant. Cependant, étant donné que l'héparinase ne conduit pas à une formation accrue de caillots, ces données suggèrent que d'autres coups, tels que des dommages à la couche endothéliale ou l'induction de l'expression du facteur tissulaire procoagulant, sont nécessaires pour favoriser la thrombose veineuse.

L'excrétion du glycocalyx endothélial a été observée dans de nombreuses conditions inflammatoires18,22,23,27, cependant, l'effet de l'inflammation sur les cellules artérielles ou veineuses et le résultat en termes de perturbation du glycocalyx sont largement inconnus. Ici, nous montrons que le glycocalyx sur les EC veineux et artériels répond différemment à la fois au stress de cisaillement et aux signaux inflammatoires. La contrainte de cisaillement est connue pour influencer le développement du glycocalyx41,42,43,44,45. Un flux réduit ou perturbé sur les cellules artérielles est non seulement lié à un phénotype pro-athérogène favorisant l'athérosclérose46,47,48, mais aussi à une épaisseur réduite du glycocalyx49 qui affecte la fonction du glycocalyx provoquant l'inflammation et la coagulation. Nous avons constaté qu'il existe une dynamique distincte du glycocalyx, en particulier pour l'HS, sur les EC artériels et veineux porcins dans différentes conditions de contrainte de cisaillement. Le HS sur les cellules artérielles n'est exprimé que sous flux, alors que sur les cellules veineuses, il est présent même dans des conditions statiques (Fig. 1). Nous avons étudié l'expression des chaînes latérales de glycosaminoglycanes (GAG), cependant, on ne sait toujours pas comment la contrainte de cisaillement influence les protéines centrales qui sont les points d'ancrage des différentes chaînes latérales de GAG. Il est possible que les protéines de base exprimées dans des conditions statiques soient décorées par un ensemble différent d'unités disaccharidiques N-substituées (colorées par un anticorps anti-HS) et N-non substituées (colorées par WGA-Lectine) que sous flux, expliquant la présence de HS mais faible expression de GlcNAc/Sia sur les EC veineux dans des conditions statiques. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour étudier les protéines de base en plus des chaînes latérales GAG spécifiques dans des conditions statiques et d'écoulement. De plus, la distribution de HS sur la surface cellulaire est influencée par les changements de contrainte de cisaillement. HS se regroupe dans des régions spécifiques de la membrane cellulaire sous fort cisaillement, tandis qu'il se distribue le long des jonctions cellulaires dans des conditions de faible cisaillement (Fig. 1). La redistribution des composants du glycocalyx comme le syndécan-4 aux radeaux lipidiques a été observée par Zeng et al.41 et a été suggérée pour permettre l'agrégation des molécules de signalisation et induire la transduction du signal. Fait intéressant, il a également été démontré que le regroupement de HS dans les régions membranaires jonctionnelles riches en lipides facilitait l'entrée du virus SARS-CoV 2 dans les cellules hôtes50. Par conséquent, les variations de la distribution de HS sur les EC artériels ou veineux pourraient déterminer une prédisposition différente à l'activation cellulaire ou à l'infection virale.

La dynamique du glycocalyx entre les cellules artérielles et veineuses diffère également lors de l'activation des CE. En accord avec des études antérieures22,23,25,26,51,52,53, nous avons observé l'excrétion de HS de la surface cellulaire des cellules artérielles stimulées avec du sérum humain normal, du TNFα et du LPS. Étonnamment, la HS sur les cellules veineuses n'a pas été affectée (Figs. 2, 3), ce qui suggère que la HS sur les EC veineux est soit moins susceptible de se détacher, soit protégée contre la délestage. L'excrétion du glycocalyx est largement médiée par les métalloprotéinases matricielles (MMP) qui sont régulées positivement dans les CE activées par le TNFα23 et pendant la septicémie, entre autres conditions inflammatoires54. L'activité des MMP est physiologiquement contrôlée par les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases matricielles (TIMP) qui augmentent également au cours de l'inflammation55. Bien que l'expression inchangée des MMP et/ou l'activité maintenue des TIMP sur les cellules veineuses mais pas artérielles puisse expliquer la sensibilité différentielle à l'excrétion, nous n'avons pas observé de changements dans l'expression de MMP2 et TIMP1 après activation avec du sérum humain, du TNFα ou du LPS (données pas montré). Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour analyser l'expression d'autres MMP et TIMP et identifier le mécanisme à l'origine de la résistance du glycocalyx endothélial veineux à l'excrétion.

La persistance de l'HS sur les EC veineux activés implique que lors de l'activation endothéliale, les propriétés anti-inflammatoires et anticoagulantes sont conservées. Cela rend les veines potentiellement plus résistantes aux dommages vasculaires que les artères. En effet, nous démontrons que les cellules artérielles ont un phénotype anti-inflammatoire et anticoagulant HS-dépendant tandis que le HS préservé sur les cellules veineuses conduit à des résultats fonctionnels variables lors de la comparaison de différents stimuli inflammatoires. Le HS sur les cellules veineuses protégeait contre le dépôt de complément et la coagulation uniquement lorsque le TNFα ou le LPS était utilisé pour l'activation endothéliale (Figs. 4, 5). Ce rôle protecteur de HS n'a pas été observé lorsqu'une configuration de xénotransplantation a été utilisée (Figs. 2, 3). Cela pourrait être dû à la présence simultanée de plusieurs stimuli inflammatoires au cours d'un contexte de xénotransplantation qui provoquent une forte réaction inflammatoire. En fait, Wünsch et al.56 démontrent que les CE artérielles porcines produisent une réponse calcique intracellulaire soutenue au sérum humain par rapport aux cytokines pro-inflammatoires classiques.

Alors que les différences de dépôt de complément sur les CE artérielles et veineuses dépendaient du stimulus inflammatoire, l'adhérence des PBMC s'est produite de manière cohérente sur les deux types de cellules (Figs. 3, 5). La liaison des PBMC aux cellules veineuses était corrélée à l'expression de la surface cellulaire de la sélectine E (Fig. S2 supplémentaire) alors qu'il est intéressant de noter que l'adhésion aux cellules artérielles a également été observée dans des conditions non inflammatoires où le HS était simplement retiré de la surface cellulaire par traitement à l'héparinase. Cela suggère que l'excrétion de HS des cellules artérielles est suffisante pour induire l'adhésion des leucocytes. On ne sait pas si le traitement à l'héparinase sur les cellules artérielles expose des molécules d'adhésion supplémentaires autres que la sélectine E.

L'importance de l'excrétion de glycocalyx pour l'adhésion des leucocytes a fait l'objet de débats. D'une part, un glycocalyx intact peut protéger les sélectines et empêcher la liaison des leucocytes, car l'épaisseur du glycocalyx intact dépasse normalement la longueur des molécules d'adhésion57. D'autre part, le glycocalyx séquestre les chimiokines pour maintenir des concentrations locales élevées et favoriser le recrutement des leucocytes58. Étant donné que l'adhésion et l'extravasation des leucocytes se produisent généralement dans les veinules59, nous suggérons que les EC veineux pourraient maintenir activement leur glycocalyx pour favoriser la séquestration des chimiokines et favoriser le recrutement des leucocytes pendant l'inflammation. Des études incluant des chimiokines ainsi que des stimuli inflammatoires seraient nécessaires pour tester cette hypothèse. En revanche, l'excrétion de HS sur les CE artérielles pourrait réduire l'épaisseur du glycocalyx et exposer ainsi les molécules d'adhésion conduisant à une adhésion accrue des leucocytes. Fait intéressant, McDonald et al.17 montrent que l'élimination enzymatique du glycocalyx des EC artériels cultivés en flux, même sans stimulus inflammatoire, a augmenté l'expression d'ICAM-1 et l'adhésion des leucocytes. Cela suggère que l'excrétion de HS pourrait non seulement réduire l'épaisseur du glycocalyx, mais également conduire à une expression accrue des molécules d'adhésion sur les CE artérielles. Cependant, pour les vaisseaux veineux, il a été montré que la liaison des globules blancs se produisait sans perte de glycocalyx après un stimulus inflammatoire60. Cela suggère que des facteurs supplémentaires à l'épaisseur du glycocalyx pourraient jouer un rôle, un exemple étant la densité du glycocalyx. Platts et al.61 suggèrent qu'il y a un "relâchement" du glycocalyx de la veinule post-capillaire après une lésion d'ischémie/reperfusion, permettant au colorant fluorescent de pénétrer plus près de la couche EC. Ce phénomène pourrait également s'appliquer aux leucocytes circulants. Un glycocalyx plus "lâche" sur les EC veineux pourrait permettre aux PBCM de se lier même avec un glycocalyx intact. Nos données sur la couverture du glycocalyx montrent une couverture plus faible sur les cellules veineuses que sur les cellules artérielles, ce qui suggère que le glycocalyx veineux est moins dense et peut-être plus permissif à l'adhérence des leucocytes. Sur les EC artériels, où la couverture de glycocalyx est plus dense, la perte est susceptible d'exposer les molécules d'adhésion responsables de la liaison des leucocytes.

L'excrétion de glycocalyx est également connue pour induire un phénotype EC procoagulant. En fait, nous avons observé que l'excrétion de HS des cellules artérielles augmente la formation de caillots (Figs. 3, 5). Encore une fois, le traitement à l'héparinase était suffisant pour induire ce phénotype EC procoagulant. En revanche, sur les EC veineux, où le HS était préservé, la coagulation n'a été observée qu'après activation xénogénique alors qu'elle ne s'est pas produite après stimulation par le TNFα ou le LPS (Figs. 3, 5). Bien que les cytokines pro-inflammatoires et les endotoxines soient considérées comme prothrombotiques62,63, le TNFα n'induit pas directement la thrombose veineuse64,65. Les souris knock-out pour le récepteur TNFα développent également des thrombi après ligature de la veine cave inférieure65. Cela suggère que des changements dans l'expression de surface des protéines pro-thrombotiques, comme le facteur tissulaire, plutôt que des cytokines pro-inflammatoires pourraient entraîner une thrombose veineuse66.

Pris ensemble, nos résultats indiquent que les cellules artérielles sont plus sensibles à l'excrétion de HS. En effet, l'élimination de HS de la surface des cellules artérielles est suffisante pour initier une réponse inflammatoire et thrombotique. Au lieu de cela, les cellules veineuses, sur lesquelles HS est maintenu, nécessitent d'autres "coups" en plus de l'excrétion de glycocalyx pour perdre leur phénotype anti-inflammatoire et anticoagulant. Par conséquent, cela suggère que les EC veineux, par rapport aux EC artériels, sont potentiellement plus résistants aux agressions inflammatoires. Des approches thérapeutiques distinctes doivent être envisagées pour différents types de cellules : alors que la reconstitution de la perte de HS serait bénéfique sur les EC artériels, d'autres approches qui ne ciblent pas la récupération du glycocalyx doivent être envisagées pour les EC veineux. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre le mécanisme derrière la résistance veineuse à l'excrétion de HS.

Alors que les systèmes microfluidiques gagnent en popularité pour la recherche in vitro, il est important de mentionner que ces systèmes peuvent encore différer de la situation in vivo. Il convient également d'ajouter que les recherches décrites ci-dessus se sont concentrées sur les CE macrovasculaires, mais les CE microvasculaires et spécifiques aux organes doivent également être analysées afin d'élargir les connaissances actuelles sur l'hétérogénéité de la dynamique du glycocalyx.

Toutes les données pertinentes sont contenues dans le manuscrit.

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La microscopie confocale et de fluorescence a été réalisée sur un équipement pris en charge par le Microscopy Imaging Center (MIC), Université de Berne, Suisse.

Ce travail a été financé par le Fonds National Suisse de la Recherche Scientifique (FNS), Grant No. 310030_182264.

Département de recherche biomédicale (DBMR), Université de Berne, Murtenstrasse 24, 3008, Berne, Suisse

Anastasia Milusev, Alain Despont, Jane Shaw, Robert Rieben & Nicoletta Sorvillo

Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences (GCB), Université de Berne, Berne, Suisse

Anastasia Milusev

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Correspondance à Nicoletta Sorvillo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Milusev, A., Despont, A., Shaw, J. et al. Les stimuli inflammatoires induisent l'excrétion d'héparane sulfate des cellules endothéliales porcines artérielles mais non veineuses, entraînant des réponses pro-inflammatoires et procoagulantes différentielles. Sci Rep 13, 4483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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Reçu : 12 décembre 2022

Accepté : 10 mars 2023

Publié: 18 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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